2024 诺贝尔生理学或医学奖:microRNA 开启基因调控新维度-北京意昂3(TransGen Biotech)_官方主页

意昂3_意昂3平台_意昂3代理-「官方直营招商注册入口」


2024 诺贝尔生理学或医学奖:microRNA 开启基因调控新维度


2024 年诺贝尔生理学或医学奖的颁布,再次吸引了全球科学界的目光。今年,这一殊荣授予了两位科学家:Victor Ambros和Gary Ruvkun,他们因发现microRNA及其在基因转录后调控的作用,获得2024年诺贝尔生理学或医学奖。

2024年诺贝尔生理学或医学奖获奖者,Victor Ambros和Gary Ruvkun

图1 2024年诺贝尔生理学或医学奖获奖者,Victor Ambros和Gary Ruvkun


microRNA 的发现过程

故事要从 20 世纪 80 年代末说起,Ambros和Ruvkun一直在研究秀丽隐杆线虫(现在都已成为模式生物了)的生命进程,他们将目标锁定在了两个突变株 “lin-4” 和 “lin-14”上。Ambros惊奇地发现,lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “负调控者”,但其中的抑制机制却如同笼罩在一层迷雾之中,让人捉摸不透。

时光流转,Ambros直到博士后生涯结束,才在哈佛大学的实验室里意外迎来了重大突破。他发现,lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因,极有可能是 lin-4 产生的一种超短 RNA。与此同时,Ruvkun也有了惊人发现,他察觉到 lin-4 并不影响 lin-14 基因产生mRNA,而是阻止 mRNA 产生蛋白质。并且,他还找到了 lin-14转录mRNA 上的一个关键位置,这个位置就是 lin-4 对其进行抑制的结合位点。

当Ambros和Ruvkun交流彼此的发现后,一个具有突破性的结论诞生了:lin-4 中的超短 RNA 与 lin-14 中 mRNA 的关键片段序列互补,正是通过这种奇妙的结合,超短 RNA 如同一个“开关”,“关闭”了 lin-14基因的表达,阻止它产生蛋白质。这一发现,揭开了以前从未被知晓的、基于 microRNA 的基因调控机制。因为在此之前,科学家们一直认为是一种名为 “转录因子” 的特殊蛋白质,通过与 DNA 的特定区域结合,来决定产生哪些 mRNA,从而实现基因调控。

Ambros和Ruvkun发现lin-4来源的microRNA过程

图2  Ambros和Ruvkun发现lin-4来源的microRNA过程

限于当时的环境和人们的认知,他们的发现之路并非一帆风顺。1993 年,当Ambros和Ruvkun在《Cell》杂志上发表这一创新成果时,却并没有引起科学界过多的关注。尽管这是前所未有的重大发现,但科学界却认为这种机制可能仅仅是秀丽隐杆线虫的独特特性,与人类和其他更复杂的动物毫无关系。

但命运的转折总是充满戏剧性,2000 年时,当Ruvkun研究小组公布他们发现的另一种由 let-7 基因编码的 microRNA 时,曾经的沉默瞬间被打破,引起了巨大的轰动。因为与 lin-4 不同,let-7 基因普遍存在于整个动物界。这一惊人发现如同在科学界投下了一颗重磅炸弹,引发了一场激烈的研究热潮。在接下来的几年里,数百种不同的 microRNA 被一一鉴定出来。

Ruvkun克隆第二个编码microRNA的基因let-7

图3  Ruvkun克隆了第二个编码microRNA的基因let-7,该基因在进化中是保守的且普遍存在于整个动物界

如今,人体内超过一千种 microRNA 已被发现。可以毫不夸张地说,没有它们,细胞和组织就无法正常发育,而它们的异常和突变甚至可能引发癌症等严重疾病。microRNA 的出现,就像是为生命的基因调控世界打开了一扇全新的大门,揭示了一个全新的维度,它对所有复杂的生命形式都至关重要。

自1993-2000发现microRNA开始的microRNA研究进程

图4 自1993-2000发现microRNA开始的microRNA研究进程


microRNA 的应用

近些年来由于对microRNA研究的比较多,我们知道microRNA 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子。它通过与靶 mRNA 结合,抑制其翻译或促进其降解,从而在转录后水平调控基因表达。

microRNA的开创性发现揭示了基因调控的一个新维度

图5 microRNA的开创性发现揭示了基因调控的一个新维度

医学领域

在医学领域,microRNA 展现出了巨大的潜力,可作为疾病的重要生物标志物。例如,众多研究已表明,在某些癌症中,特定的 microRNA 表达水平会发生显著变化。Lan 等人在权威期刊《Biomedical Research International》发表的论文中深入探讨并强调了 microRNA 作为癌症潜在生物标志物的重大意义。以肝癌为例,大量研究发现,在不同类型的癌症(肺癌、肝癌、结直肠癌等)患者中,不同的microRNA的表达水平有非常明显的变化。通过对血液中microRNA含量的精准检测,能够为癌症的早期诊断提供极为重要的参考依据。

同时,microRNA 为疾病治疗开辟了新的策略。Krützfeldt 等人在国际著名期刊《Nature》发表的研究中,创新性地介绍了 “antagomirs” 这种反义寡核苷酸,它可在体内有效地沉默 microRNA。通过使用特定的 microRNA 模拟物或抑制剂,可以精准地调节相关基因的表达,进而为疾病治疗带来新的希望。在一些癌症的治疗研究中,科学家们积极探索使用 microRNA 抑制剂来抑制肿瘤细胞的生长和扩散。例如,针对某些特定类型的癌症,研究人员发现特定的 microRNA 抑制剂能够靶向作用于肿瘤细胞中的关键基因,从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移,为癌症治疗提供了新的思路和方法。

农业领域

在农业领域,microRNA 在植物的生长发育和抗逆性中起着至关重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》发表的文章中,系统地强调了 microRNA 在作物复杂性状改良中的重要意义。通过调控植物中的 microRNA 表达,可以有效地改良农作物的品质和产量。比如,在面对干旱、盐碱等不良环境时,调节与植物抗逆性相关的 microRNA,可以显著提高农作物的耐受性。此外,还可以利用 microRNA 技术来培育具有特定性状的转基因农作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探讨了 microRNA 介导的基因调控在植物基因工程中的潜在应用。通过对特定 microRNA 的调控,可以实现对农作物生长发育过程的精准干预,培育出具有高产、优质、抗逆等优良性状的农作物品种,为农业生产的可持续发展提供了新的技术手段。


研究方法

那么如何研究 microRNA 呢? 常用的实验方法和技术手段也是丰富多样的,下面跟大家介绍一些常用的实验研究方法。

① Northern Blot

这是一种经典的 RNA 检测方法。通过电泳将 RNA 分离,然后将其转移到膜上,利用特定的 microRNA 探针进行杂交,检测 microRNA 的表达水平。虽然该方法相对较为繁琐,但具有较高的特异性和准确性。

Northern Blot检测的灵敏度和准确性

图6 Northern Blot检测的灵敏度和准确性


② 基因芯片技术

这是一种高通量的检测方法,可以同时检测大量 microRNA 的表达水平。通过将已知的 microRNA 探针固定在芯片上,与样本中的 microRNA 进行杂交,然后利用荧光或其他信号检测技术,快速获取样本中 microRNA 的表达谱。这种方法能够全面地了解不同生理或病理状态下 microRNA 的变化情况,为研究 microRNA 的功能提供重要线索。这种方法成本较高;可能存在假阳性和假阴性结果;对样本的质量和数量要求较高。

③ 实时定量 PCR(RT-qPCR)

该方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高灵敏度和特异性,能够准确地检测出微量的 microRNA。通过设计针对特定 microRNA 的引物和探针,利用 PCR 技术对 microRNA 进行扩增,并实时监测扩增过程中的荧光信号变化,从而计算出 microRNA 的相对或绝对表达量。由于其操作相对方便,方法简单,通量高,已经成为实验室里面常用的一种检测microRNA的方法了。

这种方法首先要把 RNA 提取出来,microRNA 的 qPCR 的检测与正常的基因无明显差异,但由于 microRNA 比较小,所以需要的特殊的反转录方法。常用的反转录方法有两种,一种为茎环法(Stemloop specific primer),一种为加尾法(Universal primer)。

microRNA常见的2种反转录的方式

图7 microRNA常见的2种反转录的方式


④ RNA 干扰技术

这是一种研究 microRNA 功能的有力工具。通过导入特定的小干扰 RNA(siRNA)或 microRNA 抑制剂,可以特异性地抑制目标 microRNA 的功能。相反,使用 microRNA 模拟物可以增强 microRNA 的活性。通过观察细胞或生物体在 microRNA 功能改变后的表型变化,可以推断出 microRNA 的生物学功能。

⑤ 生物信息学分析

随着高通量测序技术的发展,产生了大量的 microRNA 序列数据。生物信息学方法可以用于分析这些数据,预测新的 microRNA、识别 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的进化和功能保守性。例如,利用序列比对算法,可以在不同物种中寻找保守的 microRNA,从而揭示 microRNA 在进化过程中的重要作用。

⑥ 细胞和动物模型实验

构建细胞和动物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通过在细胞系中过表达或抑制特定的 microRNA,可以观察细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程的变化。在动物模型中,可以通过基因敲除、转基因等技术来研究 microRNA 在体内的功能。例如,构建 microRNA 敲除小鼠模型,可以研究特定 microRNA 在小鼠发育、生理和疾病中的作用。

 整体原位microRNA 杂交(Whole-mount miRNA ISH)技术在生物发育中的应用

图8 整体原位microRNA 杂交(Whole-mount miRNA ISH)技术在生物发育中的应用

⑦ microRNA 活性检测方法

• 报告基因法:构建含有 microRNA 靶序列和报告基因(如荧光素酶基因)的载体,当 microRNA 与靶序列结合时,会抑制报告基因的表达。通过检测报告基因的活性变化,可以间接反映 microRNA 的活性。其中荧光素酶报告系统由于操作简单、灵敏度高,已广泛的应用于microRNA的活性及靶标检测。更详细的方法可以参看下方的视频。

复制下方链接,可查看完整视频

http://www.axfhj.com/technology_video.html

• Western blot 检测靶蛋白法:microRNA 通过与靶 mRNA 结合抑制其翻译,从而降低靶蛋白的表达水平。通过 Western blot 技术检测靶蛋白的表达量变化,可以推断 microRNA 的活性。

• RNA 结合蛋白免疫沉淀法(RIP):利用抗体特异性地结合与 microRNA 结合的 RNA 结合蛋白,然后通过免疫沉淀分离出与该蛋白结合的 RNA,包括 microRNA 和其靶 mRNA。通过检测沉淀下来的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量,可以分析 microRNA 的活性及其与靶 mRNA 的结合情况。


TransGen 相关产品

EasyPure® miRNA Kit

小 RNA 提取试剂盒 (ER601)

产品特点

操作安全性提高:使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿

适用于从细胞、组织、新鲜血液、外泌体中提取 miRNA 和 Total RNA

通过调整加入水相中无水乙醇的用量,可获得:

1. RNA 离心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后,将流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再经 miRNA 离心柱吸附 Small RNA;

2. RNA 离心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)

裂解能力强、提取量高、应用范围广

数据展示

分别用 miRNA 提取产品提取 miRNA,2 个重复,用 miRNA 反转录产品反转后进行 qPCR 检测

miRNA 反转录产品反转后进行 qPCR 检测数据展示

miRNA 反转录产品反转后进行 qPCR 检测数据展示

TransZol Up

强化 RNA 提取试剂盒 (ET111)

产品特点

与其它总 RNA 提取试剂相比,裂解能力强、速度快,RNA 的提取量与纯度更高。

• 操作安全性提高:使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿

• 适用于快速提取多种组织和细胞中的总 RNA

• 应用范围广:动物、植物组织、血液和细菌等样品。小量样品 (50-100 mg 组织、5×106 细胞、200 μL 血液 )。大量样品 ( ≥1 g 组织或 ≥107 细胞 )

• 提取速度快:一个小时内可完成反应

• 操作可视化:溶液呈粉红色,便于分离水相和有机相

• 提取纯度高:DNA 和蛋白质的污染低

• RNA 溶解液:便于 RNA 保存和降低对反转录反应的抑制

数据展示

Trans2K®PUS II DNA Marker

Trans2K®PLUS II DNA Marker

TransScript® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

TransScript miRNA cDNA 第一链合成试剂盒 (AT351)

产品特点

适用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的样品反转录

优化的加尾酶和反转录酶配比及反应缓冲液,确保 miRNA 的反转录效率

Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反应体系中一步完成

数据展示

批次间稳定性好

使用不同批次产品分别以从人血浆中提取的 miRNA 为模板,进行 qRT-PCR 检测,根据 Cq 值变化判断该产品批次间的稳定性。

qRT-PCR 检测Cq值

反转录效率高

使用 TransGen 和 Company TA 产品,分别以从人血浆中提取的miRNA 为模板,进行 qRT-PCR 检测,根据 Cq 值变化分析反转录效果。

qRT-PCR 检测CP值

TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix

TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成试剂盒 (AT311)

产品特点

在同一反应体系中,同时完成反转录与基因组 DNA 的去除,操作简便,降低污染几率

★ 产物用于 qPCR:反转录 15 分钟;产物用于 PCR:反转录 30 分钟

反应结束后,同时热失活 RT/RI 与 gDNA Remover

合成片段 ≤12 kb

数据展示

▶ 反转录效率高

Trans2K®Plus II DNA Marker

▶ 高效基因组去除

使用不同批次产品分别以人 100 ng 总 RNA、人 100 ng 总 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 为模板,进行 RT-PCR 检测,1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析模板 DNA 去除效果;qRT-PCR 检测 18S DNA 表达量。

Trans2K®Plus II DNA Marker

13.png


PerfectStart® Green qPCR SuperMix

染料法荧光定量预混试剂(AQ601)

产品特点

3 种抗体封闭,特异性高,灵敏度高,扩增效率强,适用物种范围广

双阳离子缓冲液,增强特异性,减少引物二聚体形成,数据准确

配有适用于不同机型的 Universal Passive Reference Dye ( 调整 PCR 加样误差引起的管间差异 ),校正孔间信号误差

数据展示

▶ 扩增效率高

以梯度稀释的质粒 DNA (10 ng ~ 0.1 pg,10 倍稀释 ) 为模板进行扩增得到的扩增曲线和标准曲线。结果显示,TransGen 产品扩增效率较高,可得到漂亮的扩增曲线和标准曲线。

14.png

14-1.png

▶ 不同物种模板扩增

以不同物种的 RNA 反转录 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 为模板分别使用 TransGen 与 Company T 的产品进行扩增 (NTC 无扩增 )。结果显示,TransGen 产品扩增效果与 Company T 产品基本一致。

15.png


产品信息

产品信息


精选文献

• Duan H J, Chu H Q, Cao T M, et al. Investigation of the cell composition and gene expression in the delayed-type hypersensitivity tuberculin skin test[J]. Military Medical Research, 2023. 使用产品TransZol Up (ET111)

• Wang D, Xu C, Yang W, et al. E3 ligase RNF167 and deubiquitinase STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression[J]. Molecular cell, 2022. 使用产品TransZol Up (ET111)

• He X, Yang L, Huang R, et al. Activation of CB2R with AM1241 ameliorates neurodegeneration via the Xist/miR‐133b‐3p/Pitx3 axis[J]. Journal of cellular physiology, 2020. 使用产品EasyPure® miRNA Kit (ER601)

• Huang R, Jia B, Su D, et al. Plant exosomes fused with engineered mesenchymal stem cell‐derived nanovesicles for synergistic therapy of autoimmune skin disorders[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2023. 使用产品TransScript® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

• Zhao J, Zeng X, Liu J, et al. Marasmius androsaceus mitigates depression-exacerbated intestinal radiation injuries through reprogramming hippocampal miRNA expression[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023. 使用产品TransScript® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

• Gong Q, Wang Y, He L, et al. Molecular basis of methyl-salicylate-mediated plant airborne defence[J]. Nature, 2023. 使用产品TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix

• Wan W, Dong H, Lai D H, et al. The Toxoplasma micropore mediates endocytosis for selective nutrient salvage from host cell compartments[J]. Nature communications, 2023. 使用产品TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis

• Bing C, Kangyu J, Jingyi D, et al. LuHypocretin-1/hypocretin receptor 1 regulates neuroplasticity and cognitive function through hippocampal lactate homeostasis in depressed model. Advanced science, 2024. 使用产品PerfectStart® Green qPCR SuperMix

• Zhang B, He P, Lawrence J E G, et al. A human embryonic limb cell atlas resolved in space and time[J]. Nature, 2023. 使用产品PerfectStart® Green qPCR SuperMix


展望

对 microRNA 的未来研究充满期待。在研究方向上,科学家们将进一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理过程中的作用机制,以及与其他基因调控因子的相互关系。在疾病治疗方面,有望开发出基于 microRNA 的新型药物,为癌症等严重疾病的治疗带来新的突破。同时,随着技术的不断进步,对 microRNA 的检测和调控方法也将更加精准和高效。


涉及到的参考文献

• Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993;75(5):843-854. doi:10.1016/0092-8674(93)90529-y

• Wightman B, Ha I, Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 1993;75(5):855-862. doi:10.1016/0092-8674(93)90530-4

• Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kurodak MI, Maller B, Hayward DC, Ball EE, Degnan B, Müller P, Spring J, Srinvasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P, Davidson E, Ruvkun G. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 2000;408(6808):86-89. doi:10.1038/35040556

• http://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2024/press-release/

• Lan, H., Lu, H., Wang, X., & Jin, H. (2015). MicroRNAs as potential biomarkers in cancer: opportunities and challenges. Biomedical Research International, 2015, 125094.

• Sundarbose, K., Kartha, R. V., & Subramanian, S. (2013). MicroRNAs as biomarkers in cancer. Diagnostics (Basel), 3(1), 84–104.

• Krützfeldt, J., Rajewsky, N., Braich, R., Rajeev, K. G., Tuschl, T., Manoharan, M., & Stoffel, M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature, 438(7068), 685–689.

• Esau, C., Davis, S., Murray, S. F., Yu, X. X., Pandey, S. K., Pear, M.,... & Lollo, B. A. (2006). miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell metabolism, 3(2), 87–98.

• Eva van Rooij. "The art of microRNA research." Circulation Research 108.2 (2011): 219-234. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.110.227496.

• Tang, J., & Chu, C. C. (2017). MicroRNAs in crop improvement: fine-tuners for complex traits. Nature Plants, 3, 17077.

• Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., & Anderson, T. A. (2006). Plant microRNA: a small regulatory molecule with big impact. Developmental Biology, 289(1), 3–16.

• Zhou, M., & Luo, H. (2013). MicroRNA-mediated gene regulation: potential applications for plant genetic engineering. Plant Molecular Biology, 83(1-2), 59–75.

• Zheng, L. L., & Qu, L. H. (2015). Application of microRNA gene resources in the improvement of agronomic traits in rice. Plant Biotechnology Journal, 13(2), 329–336.

• Kim, D. H., Saetrom, P., Snove, O., Jr., & Rossi, J. J. (2008). MicroRNA-directed transcriptional gene silencing in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(42), 16230–16235.

• Wienholds, E., Koudijs, M. J., van Eeden, F. J., Cuppen, E., & Plasterk, R. H. (2003). The microRNA-producing enzyme Dicer1 is essential for zebrafish development. Nature Genetics, 35(3), 217–218.

• Wang, K., Zhang, S., Wu, H., Ma, L., & Wang, P. (2015). MicroRNA biosensors: opportunities and challenges among conventional and emerging detection methods. Biosensors and Bioelectronics, 66, 160–170.

• Fang, X., & Tan, W. (2013). MicroRNA detection using microarrays: challenges and promises. Biosensors and Bioelectronics, 41, 49–55.

登录

captcha

注册

*收货地址:
captcha

客服

微信

友情链接: