单细胞转录组测序
近年来，随着科学技术水平的更新换代，越来越多的单细胞技术得到了发展。如人类细胞图谱、小鼠细胞图谱、小鼠RNA图谱、小鼠ATAC图谱和植物细胞图谱等大型项目，已经产生了大量单细胞组学数据。通过空间转录组学和单细胞多组学，甚至可以解读空间动态多级调控机制。这些单细胞技术在肿瘤学、辅助生殖、胚胎发育和植物育种等领域有许多成功的应用。单细胞测序通常包括单细胞基因组测序，单细胞表观测序，以及单细胞转录组测序。我们这里以单细胞转录组测序（scRNA-seq）为例来给大家进行介绍。
单细胞测序的应用
在已经拥有RNA-Seq测序技术的前提下，我们为什么还要进行单细胞测序？单细胞测序技术之所以重要并被广泛研究和应用，主要是因为它具有以下几个关键的优势和目的：
➣ 揭示细胞异质性：在传统的群体细胞测序中，只能获得细胞群体的平均基因表达水平，这会掩盖细胞间的个体差异。单细胞测序可以揭示细胞群体内部的异质性，识别不同的细胞亚群和状态。
➣ 深入理解疾病机制：单细胞测序有助于深入理解复杂疾病的发病机制，如肿瘤的微环境、不同细胞类型的相互作用以及疾病进展过程中的细胞动态变化。
➣ 精确诊断和治疗：通过对单个细胞的基因表达和遗传变异进行分析，可以为疾病提供更精确的诊断，并有助于开发个性化的治疗方案。
➣ 细胞发育和分化研究：单细胞测序技术可以追踪细胞分化过程中的基因表达变化，揭示干细胞分化为特定细胞类型的分子机制。
➣ 免疫学研究：单细胞测序有助于研究免疫细胞的多样性和功能，理解免疫应答的复杂性，为疫苗开发和免疫治疗提供信息。
➣ 神经科学：在神经科学领域，单细胞测序可以揭示不同类型神经元的基因表达特征，增进对大脑功能和神经退行性疾病的理解。
➣ 微生物群落研究：单细胞测序技术可以分析微生物群落中的物种多样性和功能，有助于环境科学和生态学研究。
➣ 提高研究分辨率：单细胞测序提供了一种高分辨率的方法来研究生物学问题，可以观察到传统方法无法检测到的细微变化。
➣ 发现新的生物标记物：通过分析单个细胞的基因表达，可以发现与疾病相关的新的生物标记物，为早期诊断和治疗提供可能。
➣ 推动精准医疗：单细胞测序技术的发展推动了精准医疗的进步，使得医疗干预可以更精确地针对个体的细胞特征。
总之，单细胞测序技术因其能够提供细胞层面的详细和全面信息，已成为现代生物学和医学研究中不可或缺的工具。研究单细胞测序的方法有很多，每种单细胞测序技术的实验流程都有其特定的步骤和特点。我们通过以下是几种常见单细胞测序技术来为大家进行相应的介绍：
• Smart-seq2
★ 原理：对单个细胞的mRNA进行全转录组的扩增和测序。
★ 优点：提供全长转录组信息，适合于低通量、高精度的研究。
★ 缺点：通量较低，成本较高，不适合大规模样本分析。
★ 应用场景：适用于需要全长mRNA信息的研究，如可变剪接事件分析、小样本量的细胞状态研究。
SMART-Seq2实验原理
• 10X Genomics Chromium
★ 原理：基于微流控技术和油包水乳液的微滴技术，每个微滴包含一个细胞和反应所需的组分，进行cDNA合成和扩增。
★ 优点：高通量，可同时处理大量细胞；使用UMI技术，减少PCR扩增偏倚。
★ 缺点：成本较高；数据量较大，需要较强的计算资源。
★ 应用场景：适用于需要大规模单细胞分析的研究，如肿瘤异质性、免疫细胞状态分析等。
★ 实验流程：
1. 细胞分离与装载：将单个细胞分离并通过微流控技术装载到芯片上。
2. 乳液滴生成：形成油包水乳液滴，每个乳液滴包含一个细胞和反应组分。
3. 细胞裂解与cDNA合成：在乳液滴内进行细胞裂解和cDNA合成。
4. 文库构建：cDNA进行扩增和标记，构建测序文库。
5. 测序：使用Chromium平台和Illumina测序技术进行测序。
6. 数据分析：包括数据解包、比对、定量、聚类分析等。
10× Genomics实验原理
• Drop-seq
★ 原理：使用微流控技术，将单个细胞与微珠结合，微珠带有独特的barcode，用于区分不同细胞的mRNA。
★ 优点：高通量，成本效益高；适用于稀有细胞类型的分析。
★ 缺点：可能存在较高的dropout率（在单细胞测序（single-cell sequencing）中，"Dropout"率是指在测序过程中，由于各种原因导致某些基因或转录本没有被检测到的现象。），即某些基因在测序中未被检测到。
★ 应用场景：适合于大规模的细胞状态和类型的分类研究。
★ 实验流程：
1. 细胞悬液制备：制备细胞悬液并通过微流控技术进行操作。
2. 微珠装载：细胞与带有独特barcode的微珠结合。
3. 乳液滴生成：形成包含细胞和微珠的乳液滴。
4. 细胞裂解与cDNA合成：在乳液滴内进行细胞裂解和cDNA合成。
5. 文库构建与扩增：构建测序文库并进行PCR扩增。
6. 高通量测序：进行高通量测序。
7. 数据分析：包括barcode解复用、比对、定量、聚类分析等。
Drop-seq实验原理
• Micro-well
★ 原理：通过微孔板技术，每个微孔捕获一个细胞，进行细胞裂解和cDNA合成。
★ 优点：操作简便，成本相对较低。
★ 缺点：通量受限于微孔板的孔数，不适合超大规模样本。
★ 应用场景：适合于中小规模的单细胞测序，如特定细胞类型的功能研究。
★ 实验流程：
1.细胞悬液制备：制备细胞悬液。
2.细胞分配：将细胞分配到微孔板的每个孔中，理想情况下每个孔一个细胞。
3.细胞裂解与cDNA合成：在孔中进行细胞裂解和cDNA合成。
4.文库构建：构建测序文库。
5.高通量测序：进行高通量测序。
6.数据分析：包括数据质控、比对、定量、差异表达分析等。
Micro-well实验原理
• SPLiT-seq
★ 原理：结合了微流控技术和微孔技术，通过物理分割单个细胞，进行测序。
★ 优点：适用于有限的细胞数量，可以结合细胞表面标记进行分析。
★ 缺点：技术操作复杂，需要特定的设备和条件。
★ 应用场景：适用于有限数量的细胞样本，需要结合细胞表面标记的研究。
★ 实验流程：
1.细胞悬液制备：制备细胞悬液。
2.细胞分配：将细胞分配到微孔板的每个孔中。
3.物理分割：物理分割每个孔以确保每个孔中只有一个细胞。
4.细胞裂解与cDNA合成：在孔中进行细胞裂解和cDNA合成。
5.文库构建：构建测序文库。
6.高通量测序：进行高通量测序。
7.数据分析：进行数据质控、比对、定量和聚类分析。
SPLiT-seq实验原理
• MARS-seq
★ 原理：基于微流控技术，通过微滴包裹单个细胞，进行mRNA捕获和测序。
★ 优点：能够提供单细胞水平的基因表达数据。
★ 缺点：可能存在较高的drop out率和基因检测的不稳定性。
★ 应用场景：适用于需要中等通量单细胞测序的研究。
★ 实验流程：
1.细胞悬液制备：制备细胞悬液。
2.微流控技术：使用微流控技术将单个细胞封装在微滴中。
3.细胞裂解与cDNA合成：在微滴中进行细胞裂解和cDNA合成。
4.文库构建：构建测序文库。
5.高通量测序：进行高通量测序。
6.数据分析：进行数据质控、比对、定量和聚类分析。
MARS-seq实验原理
每种技术的实验流程都旨在从单个细胞中获取遗传信息，并将其放大到足以进行高通量测序的水平。数据分析是单细胞测序的关键部分，需要专业的生物信息学工具和方法来处理和解释大量的数据。
Smart-seq2技术作为常用的单细胞RNA测序技术之一，它具有一些独特的优势，这些优势在某些研究场景中具有不可替代性：
1.全长转录组测序：
Smart-seq2可以提供单个细胞的全长cDNA序列，这意味着可以获得完整的mRNA信息，包括所有外显子和剪接变体。这对于鉴定和分析可变剪接事件至关重要。其他技术可能只能提供部分转录本信息，无法全面了解剪接模式。
2.低dropout率：
相比于一些基于标签的方法（如Drop-seq或10X Genomics），Smart-seq2通常具有更低的dropout率，这意味着较少的基因表达信息在测序中被遗漏。在研究稀有细胞类型时，确保所有基因表达事件都能被捕获是非常重要的。Smart-seq2较低的dropout率意味着即使是低丰度的转录本也更有可能被检测到。
3.适用于稀有或珍贵样本：
由于Smart-seq2可以提供高质量的全长转录组数据，它特别适合用于那些难以获得大量细胞或样本非常珍贵的研究。
4.高灵敏度和准确性：
Smart-seq2技术能够检测到低丰度的转录本，并且由于其较低的dropout率，它在定量基因表达方面具有较高的准确性。
5.可变剪接分析：
由能够获得完整的转录本序列，Smart-seq2特别适合于研究可变剪接事件，这对于理解基因调控和功能至关重要。
6.适用于小规模样本：
Smart-seq2技术适合于研究少量细胞，例如在研究特定类型的细胞或组织时，这可能是一个重要的优势。例如，可研究的神经元样本数量有限时，那么选择一种能够提供最全面信息的技术变得尤为重要。Smart-seq2适合这种情况，因为它可以从少量细胞中捕获完整的转录组信息。
7.技术成熟：
Smart-seq2是一种较早开发的单细胞测序技术，因此拥有更多的文献支持和成熟的实验流程。
意昂3推出的 TransNGS® Whole Transcriptome Amplification Kit（KC921）是一款能够获得单细胞全长 cDNA 扩增产物的试剂盒，以WTA Oligo(dT) 为逆转录引物，并应用合成效率高、且具有模板置换活性的逆转录酶在cDNA的3'端添加一段特殊序列，从而得到全长cDNA产物。一个单细胞文库通常可以获得10-60 ng的全长转录组扩增产物。
➣ 产品特点
• 细胞类型兼容性强，可适用于RNA含量较低的细胞（如免疫细胞）
• 组织类型兼容性强，可适用于较难解离的组织（如脑组织）
• 测序数据质量好，文库产量高，峰型优异，有效检出基因（FPKM>1）的数目高
• 样本兼容体积高达6 μl，可适配不同浓度RNA或不同数量细胞的扩增
• 操作时间短，约3小时即可完成文库构建
➣ 适用范围
1-105个哺乳动物细胞或无细胞壁结构的真核细胞（如原生质体）
10 pg-100 ng总RNA（含有poly(A)序列的mRNA）
➣ 实验数据
• 适用样本类型广泛
使用TransGen对6种不同类型细胞进行全长cDNA扩增，纯化后Qubit测定文库浓度，结果表明，TransGen产品适用于多种类型细胞，文库产量均高于800 ng。
文库产量高
文库峰型好
使用TransGen对6种不同类型细胞进行全长cDNA 扩增，纯化后Qsep100检测文库峰型，结果表明，文库峰型覆盖200-10000 bp，cDNA产物大小符合预期，峰型无异常。
测序数据质量高
使用TransGen对6种不同类型细胞进行全长扩增后进行Tn5建库，结果表明，各类型细胞文库测序数据质量高，基因覆盖度高，有效基因检出数（FPKM>1）高。
| 样品类型 | Q30 | Total mapped | GC | Exon |
| HeLa | 95.83% | 97.98% | 50.46% | 79.91% |
| CHO | 94.91% | 97.54% | 50.57% | 81.61% |
| Vero | 92.65% | 98.10% | 50.09% | 78.57% |
| B cell | 93.89% | 97.67% | 49.78% | 76.37% |
| T cell | 93.95% | 97.77% | 50.14% | 77.63% |
| NK cell | 93.92% | 97.58% | 49.39% | 75.99% |
有效基因检出数（FPKM＞1）高
• 样本投入量范围广
文库产量高
使用TransGen对不同投入量的RNA和细胞样本进行全长cDNA扩增，纯化后Qubit测定文库浓度，结果表明，不同投入量均可获得较高的文库产量，样本投入量宽泛（10 pg-100 ng）。
文库峰型好
使用TransGen对不同投入量的HeLa细胞 RNA样品进行全长cDNA扩增， 纯化后Qsep100检测文库峰型，结果表明，文库峰型覆盖200-10000 bp，cDNA产物大小符合预期，峰型无异常。
测序数据质量高
使用TransGen产品对不同投入量的HeLa细胞进行全长cDNA扩增后进行Tn5建库，结果表明，不同投入量的TransGen产品在Q30、总比对率及平均有效基因数（gene FPKM >1）表现优异，建库效果好。
样品投入量 | Q30 | Total mapped |
10 pg RNA | 95.63% | 97.64% |
100 pg RNA | 95.91% | 97.58% |
1 ng RNA | 95.78% | 98.23% |
10 ng RNA | 95.89% | 97.96% |
100 ng RNA | 95.95% | 98.07% |
样品投入量 | Q30 | Total mapped |
1 cell | 94.76% | 98.42% |
10 cells | 95.08% | 98.16% |
100 cells | 95.23% | 98.05% |
1000 cells | 95.21% | 98.22% |
10000 cells | 95.13% | 98.65% |
有效基因数（FPKM>1）
• 与竞品比较
文库产量更高
使用 TransGen、Company V和Company N产品分别对10 ng RNA和100个HeLa细胞样本进行全长cDNA扩增，纯化后Qubit测定文库浓度，结果表明，TransGen产品的文库产量均高于竞品。
文库峰型更好
使用TransGen、Company V和Company N产品分别对10 ng和100个 HeLa细胞RNA样品进行全长cDNA扩增，纯化后Qsep100检测文库峰型，结果表明，文库峰型覆盖200-10000 bp，cDNA产物大小符合预期，峰型无异常。
测序数据质量更高
使用TransGen、Company V和Company N产品分别对10 ng RNA和100个HeLa细胞进行全长cDNA扩增后进行Tn5建库，结果表明，不同投入量的TransGen产品在Q30、总比对率及平均有效基因数（gene FPKM >1）表现优异，建库效果好。
样品投入量 | 使用产品 | Q30 | Total mapped | GC | Exon |
10 ng RNA | TransGen | 93.65% | 98.21% | 93.65% | 98.21% |
Company V | 92.31% | 97.07% | 50.55% | 79.76% | |
Company N | 90.43% | 95.54% | 50.57% | 75.87% | |
100 cells | TransGen | 93.44% | 97.67% | 49.80% | 80.03% |
Company V | 91.88% | 96.84% | 49.93% | 78.35% | |
Company N | 90.50% | 95.23% | 50.64% | 77.26% |
有效基因数（FPKM>1）
10 ng RNA
100 cells
产品信息
产品名称 | 目录号 | 规格 |
TransNGS® Single Cell Full Length cDNA Synthesis&Amplification Kit | KC901 | 12/24/96 rxns |
TransNGS® Whole Transcriptome Amplification Kit | KC921 | 12/96 rxns |
